Technieken voor sequentiebepaling DNA

Het gebied van biotechnologie is een constante verandering. De snelle groei en ontwikkeling van cutting-edge onderzoek is afhankelijk van de innovatie en creativiteit van wetenschappers en hun vermogen om het potentieel in een basis moleculaire techniek te zien en toepassen op nieuwe processen. De komst van PCR opende veel deuren in genetisch onderzoek, waaronder een middel voor DNA analyse en identificatie van verschillende genen op basis van hun DNA sequenties.

DNA sequencing is ook afhankelijk van ons vermogen om gelelektroforese te gebruiken voor het scheiden van DNA-strengen die in grootte verschillen door zo weinig als een basispaar.

DNA Sequencing

In de late jaren 1970 werden twee DNA sequencing technieken voor langere DNA moleculen uitgevonden. Deze waren de Sanger (of dideoxy) methode en de methode Maxam-Gilbert (chemische splitsing). De methode Maxam-Gilbert is gebaseerd op nucleotide-specifieke splitsing door chemicaliën en wordt het best gebruikt om oligonucleotiden te sequenteren (korte nucleotide polymeren, gewoonlijk kleiner dan 50 basisparen in lengte). De Sanger-methode wordt meestal gebruikt omdat het technisch gemakkelijker is aangetoond, en met de komst van PCR en automatisering van de techniek, wordt het gemakkelijk toegepast op lange strengen van DNA, inclusief een aantal hele genen. Deze techniek is gebaseerd op ketenterminatie door dideoxynucleotiden tijdens PCR-verlengingsreacties.

Sanger Methode

In de Sanger methode wordt de DNA-streng die geanalyseerd wordt, gebruikt als een template en DNA polymerase wordt gebruikt in een PCR reactie om gratis strengen te genereren met behulp van primers.

Vier verschillende PCR-reactiemengsels worden bereid, die elk een bepaald percentage dideoxynucleosidetrifosfaat (ddNTP) analoga bevatten aan één van de vier nucleotiden (ATP, CTP, GTP of TTP). Synthese van de nieuwe DNA-streng gaat door totdat één van deze analogen is opgenomen, op welk moment de streng voorheen wordt afgekapt.

Elke PCR-reactie zal uiteindelijk een mengsel bevatten van verschillende lengtes DNA-strengen, die allemaal eindigen met het nucleotide dat dideoxy gemerkt was voor die reactie. Gelelektroforese wordt dan gebruikt om de strengen van de vier reacties in vier afzonderlijke rijstbanen te scheiden en de sequentie van de originele sjabloon te bepalen op basis van welke lengtes strengen eindigen met welk nucleotide.

In de geautomatiseerde Sanger reactie worden primers gebruikt die gemarkeerd zijn met vier verschillende gekleurde fluorescerende labels. PCR reacties, in aanwezigheid van de verschillende dideoxy nucleotiden, worden uitgevoerd zoals hierboven beschreven. Echter, vervolgens worden de vier reactiemengsels gecombineerd en toegepast op een enkele baan van een gel. De kleur van elk fragment wordt gedetecteerd met behulp van een laserstraal en de informatie wordt verzameld door een computer die chromatogrammen genereert die pieken voor elke kleur tonen, waaruit de template DNA sequentie kan worden bepaald.

Typisch is de geautomatiseerde sequencing methode alleen nauwkeurig voor sequenties tot een maximum van ongeveer 700-800 basisparen in lengte. Het is echter mogelijk om volledige sequenties van grotere genen en, in feite, hele genen te verkrijgen, met behulp van stappige methoden, zoals Primer Walking en Shotgun sequencing.

In Primer Walking wordt een werkbaar gedeelte van een groter gen sequenced met behulp van de Sanger methode. Nieuwe primers worden gegenereerd uit een betrouwbaar segment van de sequentie en werden gebruikt om door te gaan met het sequentiebepaling van het gedeelte van het gen dat buiten het bereik van de oorspronkelijke reacties ligt.

Shotgun sequencing houdt in dat het DNA-segment van belang willekeurig wordt gesneden in meer geschikte (beheersbare) grootte fragmenten, sequentieert elk fragment en regelt de stukken op basis van overlappende sequenties. Deze techniek is makkelijker gemaakt door toepassing van computer software voor het regelen van de overlappende stukken.