Hoe de polymerase kettingreactie werkt om de genen te versterken

De polymerase kettingreactie (PCR) is een moleculaire genetische techniek voor het maken van meerdere kopieën van een gen en maakt ook deel uit van het gensequentie-proces.

Hoe werkt polymerase kettingreactie?

Genkopieën worden gemaakt met behulp van een monster van DNA, en de technologie is goed genoeg om meerdere exemplaren van een enkel exemplaar van het gen in het monster te maken. PCR amplificatie van een gen om miljoenen kopieën te maken, maakt het mogelijk om detecties en identificatie van gensequenties te bepalen met gebruikmaking van visuele technieken op basis van grootte en lading (+ of -) van het stuk DNA.

Onder gecontroleerde omstandigheden worden kleine segmenten van DNA gegenereerd door enzymen die bekend staan ​​als DNA-polymerasen, die gratis deoxynucleotiden (dNTP's) toevoegen aan een stuk DNA dat bekend staat als de "template". Nog kleinere stukken DNA, genaamd "primers", worden gebruikt als uitgangspunt voor het polymerase. Primers zijn kleine mensgemaakte stukken DNA (oligomeren), meestal tussen 15 en 30 nucleotiden lang. Ze worden gemaakt door korte DNA sequenties te kennen of te gissen aan de uiteinden van het gen dat wordt geamplificeerd. Tijdens PCR wordt het DNA dat wordt gesignaleerd verhit en worden de dubbele strengen gescheiden. Bij afkoeling binden de primers aan de sjabloon (genaamd annealing) en creëer een plaats waar het polymerase kan beginnen.

De PCR-techniek

De polymerase kettingreactie (PCR) werd mogelijk gemaakt door de ontdekking van thermofielen en thermofiele polymerase enzymen (enzymen die de structurele integriteit en functionaliteit handhaven na verhitting bij hoge temperaturen).

De stappen die bij de PCR-techniek betrokken zijn, zijn als volgt:

Een mengsel wordt gecreëerd, met geoptimaliseerde concentraties van het DNA-sjabloon, polymerase-enzym, primers en dNTP's. De mogelijkheid om het mengsel te verwarmen zonder het enzym te denatureren maakt het mogelijk om de dubbele helix DNA-monster te denatureren bij temperaturen in het bereik van 94 graden Celsius.

Na de denaturatie wordt het monster afgekoeld tot een matiger bereik, ongeveer 54 graden, waardoor de annealing (binding) van de primers wordt vergemakkelijkt aan de enkelstrengs DNA-templates.

• In de derde stap van de cyclus wordt het monster opgewarmd tot 72 graden, de ideale temperatuur voor Taq DNA Polymerase, voor verlenging. Tijdens verlenging gebruikt DNA-polymerase de oorspronkelijke enkele streng DNA als een sjabloon om complementaire dNTP's aan de 3'-uiteinden van elke primer toe te voegen en een gedeelte van dubbelstrengs DNA in het gebied van het gen van belang te genereren.
• Primers die geheim zijn op DNA-sequenties die niet precies overeenkomen, blijven niet gelucht bij 72 graden, waardoor de verlenging van het gen van belang wordt beperkt.
• Dit proces van denaturering, gloeien en verlenging worden meerdere (30-40) keer herhaald, waardoor het aantal kopieën van het gewenste gen in het mengsel exponentieel wordt verhoogd.Hoewel dit proces vrijwel vervelend zou zijn als men handmatig wordt uitgevoerd, kunnen monsters worden bereid en geïncubeerd in een programmeerbare thermocycler, nu gebruikelijk in de meeste moleculaire laboratoria, en kan een volledige PCR-reactie in 3-4 uur uitgevoerd worden.

Elke denatureringsstap stopt met het verlengingsproces van de vorige cyclus, waardoor de nieuwe DNA-streng wordt afgebroken en het ongeveer ongeveer de grootte van het gewenste gen houdt.

De duur van de verlengingscyclus kan langer of korter worden, afhankelijk van de grootte van het gen van belang, maar uiteindelijk wordt door middel van herhaalde cycli van PCR de meeste templates beperkt tot de grootte van het gen van belang alleen , aangezien zij van producten van beide primers zullen zijn gegenereerd.

Er zijn verschillende factoren voor succesvolle PCR die gemanipuleerd kunnen worden om de resultaten te verbeteren. De meest gebruikte methode om te testen op de aanwezigheid van PCR-product is agarosegel-elektroforese. Welke wordt gebruikt om DNA-fragmenten te scheiden op basis van grootte en lading. De fragmenten worden dan met behulp van kleurstoffen of radioisotopen visualiseerd.

De evolutie

Sinds de ontdekking van PCR zijn andere DNA-polymerasen dan de oorspronkelijke Taq ontdekt. Sommige van deze hebben een betere 'proofreading'-mogelijkheid of zijn stabieler bij hogere temperaturen, waardoor de specificiteit van PCR wordt verbeterd en fouten worden verminderd door het invoeren van het onjuiste dNTP.

Enkele varianten van PCR zijn ontworpen voor specifieke toepassingen en worden nu regelmatig gebruikt in moleculaire genetische laboratoria. Sommige hiervan zijn Real-Time PCR en Reverse-Transcriptase PCR. De ontdekking van PCR heeft ook geleid tot de ontwikkeling van DNA-sequencing, DNA-vingerafdrukken en andere moleculaire technieken.