Methoden voor eiwitzuivering

Een belangrijk onderdeel van het onderzoek naar biotechnologie is het gebruik van eiwittechnieken om eiwitten te ontwerpen of te wijzigen met geoptimaliseerde eigenschappen voor specifieke industriële toepassingen. Hiervoor moet wetenschapper in staat zijn om eiwitten van belang te isoleren en te zuiveren, zodat hun conformaties, substraatspecificiteiten, reacties met andere liganden en specifieke activiteiten kunnen worden bestudeerd.

De vereiste mate van eiwitzuiverheid hangt af van het beoogde eindgebruik van het eiwit.

Voor sommige toepassingen is een ruw extract voldoende. Voor andere toepassingen, zoals in voedingsmiddelen en farmaceutica, is echter een hoge zuiverheid vereist. Om dit te bereiken worden typische eiwitzuiveringsmethoden typisch gebruikt in een reeks zuiveringsstappen.

Elke eiwitzuiveringsstap resulteert meestal in een mate van productverlies. Daarom is een ideale eiwitzuiveringsstrategie één waarin het hoogste niveau van zuivering in de kleinste stappen bereikt wordt. De selectie van welke stappen te gebruiken is afhankelijk van de grootte, lading, oplosbaarheid en andere eigenschappen van het doelproteïne. De volgende technieken zijn het meest geschikt voor het zuiveren van een enkel cytosolisch eiwit. Zuivering van cytosolische eiwitcomplexen is ingewikkelder en vereist gewoonlijk dat verschillende methoden worden toegepast.

De eerste stap in het zuiveren van

intracellulaire

eiwitten (binnen de cel) is de bereiding van een ruw extract . Het extract zal een complex mengsel bevatten van alle eiwitten uit het celcytoplasma, en enkele extra macromoleculen, cofactoren en voedingsstoffen. Ruwe uittreksel kan voor sommige toepassingen in biotechnologie worden gebruikt, maar als zuiverheid een probleem is, moeten de volgende zuiveringsstappen worden gevolgd. Ruwe eiwit extracten worden bereid door verwijdering van cellulaire rommel die wordt gegenereerd door cellysis, die wordt bereikt met behulp van chemicaliën en enzymen, sonicatie of een franse pers.

Het puin wordt verwijderd door centrifugeren, en het supernatant wordt hersteld. Ruwe preparaten van extracellulaire eiwitten kunnen verkregen worden door simpelweg de cellen te verwijderen door centrifugeren.

Voor bepaalde biotechnologische toepassingen is er een vraag naar

thermostabiele enzymen

: Enzymen die hoge temperaturen kunnen tolereren zonder denatureren, en met behoud van een hoge specifieke activiteit. Organismen die ze produceren worden soms extremofielen genoemd. Een makkelijke aanpak om een ​​hittebestendig eiwit te zuiveren is om de andere eiwitten in het mengsel te verwarmen door te verwarmen en vervolgens de oplossing af te koelen (waardoor het thermostabiele enzym eventueel kan hervormen of opnieuw oplossen. De gedenatureerde eiwitten kunnen dan worden verwijderd door centrifugeren. Intermediaire zuiveringsstappen In het verleden was een gemeenschappelijke tweede stap om een ​​eiwit te zuiveren uit een ruw extract, bij

neerslag

in een oplossing met hoge osmotische sterkte (i.e. zoutoplossingen). Nucleïnezuren in het ruwe extract kunnen worden verwijderd door precipiteren van aggregaten gevormd met streptomycinesulfaat of protamine-sulfaat. Proteïne neerslag wordt gewoonlijk gedaan met ammoniumsulfaat als het zout. Verschillende eiwitten zullen neerslaan in verschillende concentraties van ammoniumsulfaat

. In het algemeen komen eiwitten van hogere molecuulgewicht neerslag in lagere concentraties ammoniumsulfaat. Zoute neerslag leidt meestal niet tot een hoog gezuiverd eiwit, maar kan helpen bij het elimineren van ongewenste eiwitten in een mengsel en het concentreren van het monster. Zouten in de oplossing worden dan door dialyse verwijderd door poreuze cellulosebuis-, filtratie- of gel-uitsluitingchromatografie. Moderne biotechprotocollen maken vaak gebruik van de vele commercieel verkrijgbare kits die op maat gemaakte oplossingen voor standaardprocedures leveren. Proteïne zuivering wordt vaak uitgevoerd met behulp van filters en bereid gelfiltratie kolommen. Het enige wat u hoeft te doen is de instructies volgen en voeg het juiste volume van de juiste oplossing toe en wacht de gespecificeerde tijdsduur bij het verzamelen van het eluent (wat het andere uiteinde van de kolom komt) in een nieuwe proefbuis.

Chromatografische methoden kunnen worden toegepast met behulp van bench-top kolommen of geautomatiseerde HPLC apparatuur. Scheiding door HPLC kan worden uitgevoerd door middel van omgekeerde fase, ionenuitwisseling of grootte-uitsluitingsmethoden, en monsters gedetecteerd door diode array of lasertechnologie.

Proteïnevisualisatie en beoordeling van zuivering

• Reverse-phase chromatografie

  (RPC) scheidt eiwitten op basis van hun relatieve

  • hydrofobiciteiten . Deze techniek is zeer selectief, maar vereist het gebruik van organische oplosmiddelen. Sommige eiwitten worden permanent gedenatureerd door oplosmiddelen en verliezen functionaliteit tijdens RPC. Daarom wordt deze methode niet aanbevolen voor alle toepassingen, met name als het nodig is dat het doel eiwit de activiteit behoudt. Ion-uitwisselingschromatografie verwijst naar de scheiding van eiwitten op basis van
  • lading . Kolommen kunnen ook worden bereid voor anionuitwisseling of kationuitwisseling. Anionuitwisseling kolommen bevatten een stationaire fase met een positieve lading die negatief geladen eiwitten aantrekt. Kationuitwisseling kolommen zijn de omgekeerde, negatief geladen kralen die positief geladen eiwitten aantrekken. Elutie van het doel eiwit (en) wordt gedaan door de pH in de kolom te veranderen, wat resulteert in een verandering of neutralisatie van de geladen functionele groepen van elk eiwit. Grootte-uitsluiting chromatografie ( gelfiltrering
  • ) scheidt grotere eiwitten van kleintjes, omdat de grotere moleculen sneller reizen door het verknoopt polymeer in de chromatografie kolom. De grote eiwitten passen niet in de poriën van het polymeer, terwijl kleinere eiwitten doen en langer duren via de chromatografische kolom via hun minder directe route. Eluaat wordt verzameld in een reeks buizen die eiwitten scheiden op basis van elutietijd. Gelfiltratie is een nuttig hulpmiddel voor het concentreren van een eiwitmonster aangezien het doelproteïne wordt verzameld in een kleiner elueringsvolume dan aanvankelijk aan de kolom werd toegevoegd.Soortgelijke filtratietechnieken zouden kunnen worden gebruikt bij grootschalige eiwitproductie door hun kosteneffectiviteit. Affinity chromatography is een zeer nuttige techniek voor het polijsten of het afronden van het eiwitzuiveringsproces. Kralen in de chromatografie kolom zijn verknoopt aan liganden die specifiek binden aan het doel eiwit. Het eiwit wordt dan verwijderd uit de kolom door spoelen met een oplossing die vrije liganden bevat. Deze methode geeft de zuiverste resultaten en de hoogste specifieke activiteit in vergelijking met andere technieken.
  • SDS-PAGE is polyacrylamide gelelektroforese, uitgevoerd in aanwezigheid van SDS (natriumdodecylsulfaat) dat bindt aan eiwitten waardoor ze een grote netto negatieve lading geven. Aangezien de kosten van alle eiwitten vrij gelijk zijn, scheidt deze methode ze bijna geheel op basis van grootte. SDS-PAGE wordt vaak gebruikt om de zuiverheid van eiwit na elke stap in een serie te testen. Aangezien ongewenste eiwitten geleidelijk uit het mengsel worden verwijderd, wordt het aantal bands die op de SDS-PAGE gelaald worden, verminderd totdat er slechts één band is die het gewenste eiwit vertegenwoordigt.
• Immunoblotting is een eiwit visualisatie techniek toegepast in combinatie met affiniteit chromatografie. Antilichamen voor een specifiek eiwit worden gebruikt als liganden op een affiniteitskromatografiekolom. Het doelproteïne wordt op de kolom gehandhaafd, vervolgens verwijderd door de kolom te spoelen met een zoutoplossing of andere middelen. Antilichamen gekoppeld aan radioactieve of kleurstoflabels helpen bij het detecteren van het doelproteïne zodra het van de rest van het mengsel gescheiden is.
• Bronnen: Zubay G. 1988. Biochemie, 2e editie. Macmillan Publishing Co., New York, NY, VS.

Amersham Pharmacia Biotech. 1999. Proteïnezuiveringshandboek, editie AB. Amersham Pharmacia Biotech Inc. New Jersey, VS. // www. Biochem. uiowa. edu / donelson / Database% 20items / protein_purification_handbook. pdf.