All About Restriction Enzymen

Hoeveel weet u over restrictie-enzymen? Krijg een beter begrip van wat ze doen en waarom ze belangrijk zijn, met deze beoordeling.

Restrictie-enzymen definiëren

Restrictie-endonucleasen zijn een klasse van enzymen die DNA-moleculen knippen. Elk enzym herkent een unieke sequentie van nucleotiden in de DNA-streng. Dergelijke sequenties zijn gewoonlijk ongeveer 4 tot 6 basenparen lang. De sequenties zijn palindroom omdat de complementaire DNA-streng dezelfde sequentie alleen in de omgekeerde richting heeft.

Met andere woorden, beide strengen DNA worden op dezelfde locatie geknipt.

Waar deze enzymen gevonden worden

Restrictie-enzymen worden gevonden in veel verschillende bacteriestammen waar hun biologische rol is om deel te nemen aan celverdediging. Deze enzymen "beperken" vreemd (bijvoorbeeld viraal) DNA dat de cel binnenkomt, door het te vernietigen. De gastheercel heeft een restrictie-modificatiesysteem dat zijn eigen DNA op specifieke plaatsen voor zijn respectieve restrictie-enzymen methyleert, waardoor het wordt beschermd tegen splitsing. Er zijn meer dan 800 bekende enzymen ontdekt die meer dan 100 verschillende nucleotidesequenties herkennen.

Gebruik in de biotechnologie

Restrictie-enzymen worden in de biotechnologie gebruikt om DNA in kleinere strengen te knippen om fragmentlengteverschillen tussen individuen te bestuderen (Restriction Fragment Length Polymophism - RFLP). Ze worden ook gebruikt voor het klonen van genen.

RFLP-technieken zijn gebruikt om te bepalen dat individuen of groepen individuen onderscheidende verschillen hebben in gensequenties en restrictiesplitsingspatronen in bepaalde gebieden van het genoom.

Kennis van deze unieke gebieden is de basis voor DNA-vingerafdrukken. Elk van deze methoden hangt af van het gebruik van agarosegelelektroforese voor scheiding van de DNA-fragmenten. TBE-buffer, die bestaat uit Tris-base, boorzuur en EDTA, wordt gewoonlijk gebruikt voor agarosegelelektroforese om DNA-producten te onderzoeken.

Typen restrictie-enzymen

Er zijn drie verschillende soorten restrictie-enzymen. Type I snijdt DNA op willekeurige locaties tot 1000 of meer baseparen van de herkenningssite. Type III snijdt op ongeveer 25 baseparen van de site. Typen I en III vereisen ATP en kunnen grote enzymen met meerdere subeenheden zijn. Type II-enzymen, die voornamelijk worden gebruikt in de biotechnologie, knippen DNA binnen de erkende sequentie zonder de behoefte aan ATP en zijn kleiner en eenvoudiger.

Type II-restrictie-enzymen worden genoemd volgens de bacteriesoorten waarvan ze zijn geïsoleerd. Het enzym EcoRI werd bijvoorbeeld geïsoleerd uit E. coli . Het grootste deel van het publiek is bekend met E. coli uitbraken in voedsel.

Type II restrictie-enzymen kunnen twee verschillende soorten coupes genereren, afhankelijk van of ze beide strengen in het midden van de herkenningssequentie snijden of elke streng dichter bij één uiteinde van de herkenningssequentie.

De eerstgenoemde snede genereert "stompe uiteinden" zonder uitsteeksels van nucleotiden. De laatste genereert "kleverige" of "samenhangende" uiteinden omdat elk resulterend fragment van DNA een overhang heeft die de andere fragmenten complementeert. Beide zijn bruikbaar in moleculaire genetica voor het maken van recombinant DNA en eiwitten.

Deze vorm van DNA valt op omdat het wordt geproduceerd door de ligatie (samen bindend) van twee of meer verschillende strengen die oorspronkelijk niet aan elkaar waren gekoppeld.